利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型
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利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型

2021-08-03
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       帕金森是第二大老龄化相关的神经衰退疾病。主要的生物化学改变为神经元中产生不溶性“路易小体”,其主要的成分是聚集的α突触核蛋白。α突触核蛋白在神经衰退类疾病中扮演着重要角色,如路易体痴呆,多系统萎缩症和帕金森,这些疾病统称为突触核蛋白病。在这些疾病中,α突触核蛋白集合形成更大的聚合体,也就是路易体和营养障碍性神经突。α-突触核蛋白是高度易溶的,没有内部结构的小分子蛋白,广泛存在于大脑中,主要分布于神经元突触前体内。α突触核蛋白参与突触小泡的信号分子释放,包括多巴胺,对机体运动非常重要。α突触核蛋白寡聚体(oligomers)具有神经毒性,能以类似朊病毒的方式扩散致病。


       α突触核蛋白是一种分子量为14KD的蛋白,主要存在于中脑黑质中的神经元突触前体,目前还不能完全了解其功能。α突触核蛋白的非淀粉样蛋白部分,又称NAC 区域,由中段憎水区构成,是形成蛋白聚集的必要区域。α突触核蛋白单体可以形成各种类型的寡聚体。随着寡聚体形成可溶性原纤维或纤维细丝,蛋白聚集也在持续进行。纤维细丝经过结构变化,从α螺旋结构变成β折叠,然后形成不溶性纤维。这些各种类型的蛋白以动态平衡的形式同时存在。


       StressMarq公司是神经衰退疾病研究工具行业的领先制造商,是活性α突触核蛋白单体,寡聚体,前体原纤维的独家生产商。前体原纤维,又称PFF。PFF是制作帕金森疾病模型的重要工具,它们可以大大加速α突触核蛋白单体的聚集。


       在体外通过硫磺素T作为指示剂,当蛋白聚集时形成β折叠时,可以看到增强的荧光信号,这是蛋白聚集的一种固有现象。将PFF加入到原代神经元中或者注射到啮齿动物大脑中,都可造成蛋白聚集和α突触核蛋白病理现象。路易体病理现象从注射点开始蔓延,可用129号位丝氨酸磷酸化的抗体来识别,这是可视化α突触核蛋白病理现象的最佳方法。将 PFF注射到动物脑中制作病理模型,比使用基因改造模型要快10到15倍。该方法制作疾病模型的时间要远远短于传统的基因改造小鼠、大鼠。通常注射后30天即可见到病理反应,而基因改造模型需要9个月到1年时间。为帕金森造模提供了极大的便利。α突触核蛋白PFF还可以结合荧光标记, 用于蛋白示踪。虽然路易体病理现象是突触核蛋白病的最先出现的症状, 但是α突触核蛋白寡聚体在疾病进程中也扮演重要角色,因为它们有很强的神经毒性。α突触核蛋白可以被稳定在寡聚体形式,加入到疾病模型中诱发毒性。


       StressMarq的α突触核蛋白产品线包括原纤维,寡聚体和抗体,可以用于研究α突触核蛋白的病理学和毒性特征。这给科研学者提供了有力的工具,用来构建疾病模型,检测新药,一起攻克神经衰退疾病治愈难题。

利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型

       StressMarq目前提供人源和小鼠源前体原纤维(PFFs)以及单体用于帕金森造模的研究。所有蛋白都进行了细胞检测和ThT检测。TEM 图片、ThT检测曲线以及其他检测结果可以在产品单页上看到。A53T α-突触核蛋白单体和PFFs也上线了。A53T突变型被认为与早发型帕金森疾病有关并且加速α-突触核蛋白的纤维聚化。


利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型

       大鼠原代海马神经元经过 1 型 小鼠α-突触核蛋白PFFs处理后显示出路易小体病理现象。


利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型

       大鼠脑注射了1型小鼠α-突触核蛋白 PFFs (SPR-324) 后的IHC分析,显示了α-突触核蛋白病理现象.


       StressMarq目前正在研发更多的原纤维新品用于神经衰退疾病研究,并且也在完善我们现有的产品线。下面表格列出了各种蛋白的区别:


1型PFFs(SPR-322)1型PFFs(SPR-324)1型PFFs(SPR-326)2型PFFs(SPR-317)3型PFFs(SPR-448)蛋白纤维(SPR-450)
物种来源小鼠
突变类型野生型野生型A53T野生型野生型野生型
单体来源SPR-321SPR-323SPR-325SPR-316SPR-316SPR-321
内毒素水平制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除纤维聚集之前移除了LPS (低内毒素)纤维聚集之前移除了LPS (低内毒素)制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除
ThT 检测与SPR-321 单体混合时荧光强度>12 000 荧光单位 与 SPR-316 单体混合时荧光强度为1300 荧光强度与SPR-323单体混合时荧光强度> 3100 荧光单位与SPR-325单体混合时有28 000 荧光单位与SPR-321单体混合时有3000荧光单位 与SPR-316 单体混合时有400荧光单位调研中调研中
原代细胞活性在原代大鼠细胞中会诱发路易体病理现象在原代大鼠细胞中会诱发路易体病理现象调研中在原代大鼠细胞中不会诱发路易体病理现象调研中调研中
活体内活性在大鼠大脑中注射后30天内产生病理反应在大鼠大脑中注射后30天内产生病理反应调研中调研中调研中调研中


       3型PFFs (使用新型支架制作) 与1 型 PFFs 结构和活性都相似,但是内毒素水平较低与2 型 PFFs 相似。 PFFs 不可溶而蛋白纤维可溶,但是可能根据操作手法不同会有少量不溶原纤维。抑制剂可以停滞alpha突触核蛋白的聚集,阻止寡聚体形成原纤维。以下是抑制剂阻滞的寡聚体:


盐酸多巴胺处理的寡聚体 (SPR-466)黄芩苷元处理的寡聚体 (SPR-467)EGCG 处理的寡聚体 (SPR-469)
抑制剂盐酸多巴胺 (Dopamine HCl)黄芩苷元 (Baicalein)表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)
物种来源
突变类型野生型野生型野生型
单体来源SPR-321SPR-321SPR-321
内毒素制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除制作时含有内毒素LPS, 并且没有移除

       只含有抑制剂-阻滞的寡聚体的ThT检测在24小时内没有显示荧光强度增强,当与1型单体混合时荧光强度有所增加。 但是这个增加比单独1型单体的增加要少。这说明这些抑制剂-阻滞的寡聚体减缓了单体的聚集。

利用活性α突触核蛋白构建帕金森动物模型


       ThT是一种荧光染料,可以绑定富含beta折叠的结构, 例如alpha 突触核蛋白原纤维. 抑制剂介入-盐酸多巴胺处理的寡聚体(SPR-466)显示的荧光强度和单体(SPR-321)相比要少得多。单体和抑制剂介入的寡聚体混合后显示的聚集作用很有限。



      大鼠活体注射帕金森建模和检测实验

       该实验操作指南是将1型小鼠PFFs(SPR-324)或1型人PFFs(SPR-322)注射到大鼠脑中来产生alpha突触核蛋白病理特征。小鼠PFFs显示出了更强的聚集效果。

使用的动物: 雌性 SD(Sprague Dawley) 大鼠


      2uLPFFs或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射:

      ● AP+1.6,ML+2.4,DV–4.2

      ● AP–1.4,ML+0.2,DV–2.8

      30天后, 用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开,将中脑与前脑分开。之后两部分都用4%PFA 固定48小时。

 

      DAB 操作步骤

      材料

      ● 1XTBS (含有和不含有TX-100的)

      ● 30% H2O2

      ● 柠檬酸缓冲液

      ● 驴血清(保存在-20℃;冻融稳定的)

      ● 一抗:pSYN EP1536Y (Abcam; ab51253)

      ● 二抗:生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 货号: 711-065-152)

      ● ABC 试剂 (Vector; 货号: PK-7100)

      ● DAB 试剂 (Vector; 货号: SK-4100)

      ● 孔板 (规格取决于要染色的区域数量)

      ● 漆刷

      ● 玻璃钩

      ● 漂白剂

      ● ddH20

      ● BD Luer-lock 注射器 10 mL

      ● 过滤器 0.22 uM 孔径 (Fisher 货号. SLMP025SS)

      ● 100% EtOH

      ● Histoclear (用于清理组织)

      ● 显微镜载玻片和盖玻片

      ● Permount (封片剂)

 

      第一天:(猝灭, 抗原修复, 阻断, 一抗)

      → 用 1X TBS (震荡, 室温)冲洗切片 5 次以除去冷冻保护剂。

      → 把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中,覆盖好,置于操作台 20 分钟。

      *该步骤不要用 MESH WELLS*

      用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2

      → 用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 3 次。

      → 做抗原修复时, 提前在水浴中预热柠檬酸缓冲液至少 15~30 分钟。在柠檬酸缓冲液中培养切片一小时,将温度设置为 37℃,不要震荡 。

      → 用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 3 次。

      → 阻断时, 将切片置于 5% 常规驴血清和 0.25% Triton-100 的 TBS 中阻断 1 小时,冷室、震荡。

      *注意: 可以使用含有 Triton 的 TBS 阻断液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻断液中加入驴血清来阻断。*

      用 _______ mL TBS,

      _______ uL 驴血清, _______ uL 10% TX-100

      → 用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片 3 次。

      → 用含 5% 驴血清的 TBS 制备一抗溶液,稀释度为 1:5000。用锡纸包好切片,和抗体一起在冷室中震荡培养过夜。

      用 _______ mL TBS,

      _______ uL 驴血清, _______ uL pSYN EP1536Y

 

      第二天:(二抗, ABC 扩大信号, DAB 染色)

      → 用 1X TBST (震荡,室温) 冲洗切片 3 次. 余下的步骤中,需要一直将切片保留在锡纸里,即使是冲洗的步骤。

      → 用含 5% 驴血清的 TBS 制备二抗溶液,稀释度为 1:500。在冷室中培锡纸养盖好的切片 2 小时,震荡。

      用 ______mL TBS,

      ______ uL 驴血清, _______ uL 生物素标记的驴抗兔 IgG

      → 用 1X TBST (震荡,室温) 冲洗切片 3 次。

      → 用 ABC 试剂培养切片 30 分钟 (震荡, 冷室)。

      → 用 1X TBS 冲洗切片 3 次 (震荡,室温)。

      → 用 falcon 离心管和 ddH2O 制备 DAB 溶液,每 5 mL H2O 加入如下溶液然后涡旋混合:

      2滴缓冲溶液

      4滴 DAB 溶液

      2滴过氧化氢溶液

      *注意: 所有接触过DAB 的器具只能用来操作 DAB。我们还在通风橱内准备了一个 DAB 专用的废液缸。使用玻璃钩来处理 DAB 溶液中的切片而不能用漆刷,并且操作后要用漂白剂冲洗玻璃钩。盛装过 DAB 的器皿都需要用漂白剂冲洗并且处理到生物性危害箱中。*

      → 用注射器过滤到新的6孔板中。每一个需要染色的脑切片都用一个新的 DAB 孔。

      → 在DAB中培养每个切片直到变为浅棕色(2-3分钟就足够; 时间太长可能会造成背景染色太多)

      → 用 ddH2O冲洗3次

      → 在 1X TBS 中封片,然后在切片柜中干燥过夜。

 

      第三天:(脱水和盖玻片)

      *注意: 在开始脱水步骤之前,确保浸片用的玻璃皿里有足够的液体可以盖过切片上的所有组织。*

      → 按照如下顺序和时间脱水切片:

      1.30秒ddH20

      2.3分钟70% EtOH

      3.3分钟95% EtOH

      4.3分钟95% EtOH

      5.3分钟100% EtOH

      6.3分钟100% EtOH

      *置于振荡器*

      7.5分钟 Histoclear

      8.5分钟 Histoclear

      9.5分钟 Histoclear

      → 将切片从切片篮从取出,一次一片,置于吸水纸上。

      → 加封片剂时,取一个 P1000 移液器和吸头,将吸头尖剪掉,容量设到 400 到 500 μL.

      → 连续滴几滴封片剂 Permount 到切片的中间,倾斜切片使封片剂完全覆盖切片。

      → 用棉棒的木头一端赶出切片中的气泡。

      → 将切片放在吸水纸上,置于操作台上过夜晾干。

      *注意: ~24 小时之后, 多余的 Permount 封片剂应该用 Histoclear 移除*




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全国服务热线: 4006-800-892       邮箱: 7342586190@qq.comom 

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