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免疫组化IHC常见问题

2021-06-23
浏览次数: 17


IHC信号微弱/无信号
问题解决方案
抗体效力a. 抗体效价不高。可通过增加抗体使用浓度,延长抗体孵育时间进行调整。
b. 
所用抗体不适用于IHC实验。建议在非变性WB上测试该抗体,以确保抗体识别非变性抗原,或是选用通过IHC实验验证的抗体。
c. 
一抗二抗不匹配。使用针对一抗物种来源的二抗,如一抗宿主为rabbit,则须使用anti-rabbit的二抗。
d. 
抗体失活。避免将标记荧光基团的二抗放置于光照环境。
酶底物失活或呈色时波长设置错误a. 显色溶液失去作用,可能是由于底物缓冲液中含有酶抑制剂,或底物缓冲液的pH值不适当。建议取一滴二抗标记酶与底物溶液反应可确认显色溶液是否失去活性。
b. 
错误的激发波长。呈色前确保激发波长与使用的荧光基团相匹配。
样品制备问题a. 脱蜡作用不足。建议延长脱蜡时间,使用新鲜配制的二甲苯。
b. 
固定液(福尔马林或 PFA) 可能改变表位。建议利用抗原修复方式使表位暴露出来或缩短固定作用的时间。
c. 
固定作用不适当。避免延迟固定或过度固定,一般建议至少固定6小时以上,18~24小时已可满足大多数实验应用。
d. 
冰冻切片样品保存期过长。冰冻切片制备完成后,最好于1-2个月内用完,超过6个月的话,建议制备新的玻片。
e. 
荧光染色样品保存不当。荧光基团在光线下暴露时间过长,可能会导致信号减弱,建议在避光环境下进行实验和保存样品,也可使用防荧光淬灭的封片剂封固样本。
样品属性a. 靶蛋白含量低。建议设置为阳性対照组,增加抗体使用量或利用放大步骤来放大信号。
b. 
靶蛋白为核蛋白而抗体不能穿透细胞核。建议在封闭溶液与抗体稀释液中加入渗透试剂,以促进抗体渗透到细胞内。
c. 
靶蛋白为膜蛋白而表位可能因为渗透作用被破坏或移除。建议将缓冲液中的渗透试剂减少或移除。
d. 
较厚的组织。如斑马鱼全胚胎或染色建议做细胞破膜,以便抗体顺利进入胞内与相应抗原结合。
关键步骤:在每次的实验中,设置阳性与阴性对照组,以确认是该次实验的抗体、试剂、组织切片、实验过程的问题,还是靶蛋白自身表达量低的问题。
IHC非特异性染色/背景值比较高
问题解决方案
固定方式或组织自身可能存在自发荧光a. 尝试用非醛类替代醛类。
b. 
用淬灭自发荧光的染料或方法处理组织样品:如硼氢化钠、短波长的UV照射、苏丹黑等。
c. 
将石蜡包埋样品的方法换成冰冻切片(OCT或明胶),减少固定液的影响。
d. 
选择不会与自发荧光竞争的荧光染料。福尔马林、PFA或戊二醛等会产生高背景的荧光,尤其在使用绿色、蓝色和红色波长光谱范围时;组织中的红细胞或胶原蛋白等组分会产生很强的自发荧光,尤其是使用绿色和红色通道的荧光检测时。
e. 
组织冲洗不彻底,有固定液残留。
f. 
使用福尔马林或PFA固定过久。一般建议至少固定6小时以上,18~24小时已可满足大多数实验应用,注意:如固定时间到了无法继续后续脱水、包埋程序,一定要将组织置换到PBS保存,切勿一直泡于固定液中,否则有可能造成蛋白交联无法修复。
g. 
配置新鲜的固定液
封闭、洗脱或显色问题a. 增加封闭液浓度、延长封闭时间。
b. 
更换封闭液成分,注意封闭液成分不可与一抗物种同来源,最好与二抗物种同源,如二抗来自马血清,使用马血清可得到较干净的背景。
c. 
底物过量:缩短底物孵育时间。
d. 
信号过度放大:缩短信号放大试剂孵育时间。
e. 
洗脱液不适合:如果原本是用PBS,可更换使用TBS
抗体浓度太高或非特异性结合a. 降低抗体浓度,如1100调整为11000
b. 
缩短抗体孵育时间,并在4°c 孵育。
c. 
增加封闭缓冲液浓度。
d. 
做多个目标蛋白染色时,建议使用预吸附二抗减少与其他物种一抗的交互作用。
e. 
针对二抗与组织发生非特异性结合的情况建议每次实验都要设置一组不加一抗,只加二抗的对照组,才能确认信号是来自高背景值还是真实信号。
内源性酶(过氧化氢酶或碱性磷酸酶)a. 使用酶抑制剂。
过氧化物酶:使用H2O2 (0.3% v/v)
碱性磷酸酶:使用 Levamisol (2 mM)
内源性生物素 Avidin 孵育以封闭生物素
组织问题a. 脱蜡不完全,可能导致细胞核染色在呈相时模糊,亦可能导致抗体无法辨认抗原或者高背景值。
b. 
抗原修复方式不适合,建议更换修复溶液成分或方法。
c. 
一抗与组织物种同源。较常发生在使用鼠源抗体染鼠源组织时,除了避开同样物种来源的一抗和组织之外,也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色试剂盒 (GTX83396) 迸行实验。
d. 
任何时候都不要让组织干掉。
IHC实验结果形态不佳
问题解决方案
组织切片从载玻片上脱落a. 使用新鲜配制、适当带电或疏水处理过的载玻片。
b. 
石蜡切片贴于载玻片后,于60°C烘烤3-5小时最为合适,烘烤不足容易掉片。
c. 
实验过程中要轻柔冲洗载玻片上的组织。
组织切片撕裂、褶皱或有气泡a. 切片刀钝或是刀刃上有缺口。建议使用锋利刀片重新制备切片。
b. 
刀刃上有蜡屑的积留,请随时将废屑残渣用毛刷清除干净。
c. 
刀没夹紧或刀的角度倾斜。适当调节切片刀的角度,并确认刀片和蜡块都有夹紧。
d. 
移动刀座,如果划痕还是出现在相同位置,应该是组织标本内有污物或硬物的问题。
e. 
确认组织无过度脱水,并调节适当切片速度。
f. 
在分析实验结果时,避免损坏切片区域。
g. 
避免展片时于载玻片上形成的气泡。
组织形态分辨率差a. 制备较薄的切片。一般来说,冰冻切片的片子较厚(约10-30 um),一般设定刀片温度为-10~-20度,如设定温度太低,可能会切不好;石蜡切片的片子较薄(约5-10 um)。
b. 
确认已使用适当厚度的盖玻片,如使用油镜一定要滴油。
c. 
建议使用激光共聚焦显微镜成像,去除非焦点平面的噪质。
固定不完全或造成物理损伤a. 增加固定时间。如使用4 % PFA,一般建议至少固定6小时以上,18~24小时已可满足大多数实验应用,可依据染色结果增加固定时间与/或加入后固定的步骤。注:如固定时间到了无法继续后续脱水、包埋程序,一定要将组织置换到PBS保存,切勿一直泡于固定液中。
b. 
增加固定液/组织比例,建议固定液体积至少要是组织块的20倍体积。
c. 
准备较小的组织块(约3-4 mm),以迸行更完全的浸润固定。
抗原修复过于强烈a. 凭经验决定保留组织型态的条件,同时恢复抗原的免疫反应性。理论上温度越高,酸碱值越碱,但可能造成较高的背景值或组织型态破坏,因此,建议从92°C, pH 6开始尝试,pH 6的抗原修复液即适用于大多数抗体。
b. 
使用冰冻切片样本。冰冻切片一般不做抗原修复,因为抗原修复方式对冰冻切片可能太过强烈,也不需脱蜡、覆水等步骤,能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性。
切片组织细胞形成冰晶a. 防止组织中冰晶形成:
-
速冻使组织温度骤降减少冰晶的形成。
-
固定后将组织置于20%~30%蔗糖溶液13天,利用高渗吸收组织中水分减少组织含水量,可防止或减少冰晶的形成。


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