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Peprotech细胞因子溶解稀释常见问题

2021-06-22
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Peprotech的细胞因子或重组蛋白以冻干粉的形式提供,无任何添加剂、赋形剂及蛋白载体,这使得细胞因子或重组蛋白非常稳定,在-20℃或-80℃可稳定保存数年,并且使用非常安全,对实验结果影响较小。冻干粉在使用前需进行溶解,以溶液的形式加入到培养体系或注入动物体内。溶解步骤非常关键,溶解不好会导致细胞因子或重组蛋白的活性降低或丧失,这也是许多客户经常遇到的问题。

 

那么应该如何进行正确的溶解呢?

下面以Recombinant Human IL-4(重组人IL-4,产品编号:200-04)的说明书(COA)为例,对细胞因子或蛋白的溶解方法进行详细的阐述。

拿到重组人IL-4的说明书后,您会发现有一段关于Reconstitution(重悬)的叙述,这段内容含有溶解相关的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步:开盖前离心试剂管

PeproTech 的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中,为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上,所以在打开塑料瓶盖前,需将冻干粉通过离心收集到管底,以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。

 

有很多用户会问一个问题,即应该用多少转速、多长时间离心试剂管,才能达到良好的收集效果?

答:有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有一个 Spin 键,按了此键后,离心机会自动快速上升到其最大速度(10000rpm 或 12000rpm),上升到最高点后速度即刻下降,直至停止旋转,整个过程大约 30s。这个 Spin 键足以很好的将细胞因子或蛋白收集到管底。

但有些实验室没有这样的高速离心机,只有最高转速为 4000-4500rpm 的离心机。这种情况下,需 3000-3500rpm 离心 5min,也能达到类似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第 2 步:用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml ,不可振荡。

这个步骤即为溶解步骤,非常重要。

1)一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉

用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人 IL-4 需用水溶解,而重组人 IL-2 (产品编号:200-02)则需用 100mM Acetic Acid (醋酸)溶解,重组人TGF-beta1 (产品编号:100-21)需用 10mMCitric Acid(柠檬酸),pH3.0 溶解,重组人FGF-basic(产品编号:100-18B)需用 5mMTris,pH7.6 溶解,重组人FGF-10(产品编号:100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸钠),pH7.4 溶解,重组IL-13(产品编号:200-13)需用 20mMMHCl溶解。(注:即使同一重组细胞 因子或蛋白,不同批次的溶解方法也可能有所不同,因此上面的叙述仅供参考。 具体应该如何溶解应以相应批次的官方说明书为准)。

 

经常会有客户问,为啥有多种溶解方法?

答:我们知道,蛋白的溶解性与很多因素有关,其中比较重要的是 pH 值和离子强度。PeproTech 的细胞因子或重组蛋白在出厂前均经严格测试,说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的pH 值和离子强度与说明书中所标明的不符,很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解,这样所配得的细胞因子或重组蛋白必然活性不够或丧失。


有不少用户没注意说明书上的描述,而是根据习惯,直接用 PBS 或培养液(1640或 DMEM等)等溶解细胞因子或蛋白的冻干粉。这样做可以吗?

答:有时可以,要看具体情况。PeproTech 的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是 PBS,此时千万不能用 PBS 或培养液直接来溶解,具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子,如重组人 KGF(产品编号:100-19)和重组人FGF-23(产品编号:100-52)等,说明书上的溶解液即为 1x PBS,此时用 PBS溶解完全没问题,那么用培养液溶解也是可以的,不过最好还是用先用 PBS溶解,然后再用培养液稀释。

2)一定要溶解到指定的浓度。

蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性,这个范围就是说明书上所标明的浓度范围,该例为 0.1-1.0 mg/ml。这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。如重组人FGF-6(产品编号:100-30)为 0.5-1.0mg/ml,而重组人Activin B(产品编号:120-15)则一定要是0.5mg/ml。

 

高于或低于该浓度范围会有什么问题呢?

答:首先,细胞因子或蛋白会不稳定,即很容易出现活性下降的现象。其次,高于这个浓度范围,可能会超过该蛋白的最大溶解浓度,即蛋白无法完全溶解。再者,高于或低于该浓度范围,蛋白可能会出现聚集(aggregation),最终结果还是部分蛋白未溶解,导致蛋白活性的减弱。

3)一定不能振荡(vortex)。

这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。

 

有用户会问,若想保证溶解液与冻干粉充分混匀,以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解,该怎么办呢?

答:多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的,一般我们用移液枪的枪头轻吹几下,即可使细胞因子或重组蛋白完全溶解。对于不易溶解的细胞因子或蛋白,PeproTech 会在说明书中进行备注(Note)。如在重组人 IL-13(产品编号:200-13)的说明书中您会看到:Slow to dissolve (缓慢溶解),在重组人 IL-11(产品编号:200-11)的说明中会看到:This solution is slow to dissolve.(该溶液溶解缓慢)。这种情况下,您最好能将要溶解的细胞因子或重组蛋白放在水平摇床(shaker)上低速摇一段时间,促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。有些蛋白,如重组人 IL-13 Variant (产品编号:200-13A)虽然难溶,但却不需用摇床来加速溶解。其说明书上的备注为:Allow the reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use.(将重悬液在 4℃静置2小时以上)。

The solution can be stored at 2-8℃ for up to one week.

第3步:该重悬液在2-8℃最长可保存1周。

用说明书上推荐的溶液重悬细胞因子或重组蛋白至推荐的浓度后,可置于2-8℃储存,在此条件下其活性最长可保持1周。这对于周期为5-7天的实验,如DC(树突状细胞)的诱导成熟是足够的。在此期间,只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白重悬液加入到培养体系即可。一般说明书上推荐的重悬浓度要高于实验时使用的浓度,此时可能需要对重悬后的溶液进行稀释。如需进行稀释,必须遵循第4步中的方法要求,使用含载体蛋白的溶液进行稀释。否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中细胞因子的或重组蛋白的浓度下降,总的蛋白活性大为减弱。

For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein(example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃。

第4步:如果要长期保存,需使用含载体蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液进一步稀释,然后分装冻存于-20℃至-80℃。

如果实验周期长于一周,或配制的细胞因子或蛋白一次用不完,则需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法:将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白,如0.1% BSA(牛血清蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白)的溶液进一步稀释,然后分装冻存于-20℃至-80℃。

经常有客户使用COA上推荐的溶液重悬细胞因子或重组蛋白冻干粉后不使用含载体蛋白的

 

溶液进行稀释,而是直接分装冻存于-20℃至-80℃,这样可以吗?

答:不可以的。我们知道塑料管壁对多数蛋白均具有很好的吸附作用,也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后,蛋白是很难与管壁分离的,例如ELISA的包被抗体(Capture antibody)就是通过这种粘附作用包被到酶标板上的。

载体蛋白,如0.1% BSA(牛血清蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白)的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点,使细胞因子或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释,而直接分装冻存,则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上,导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白浓度大为降低,最终表现为细胞因子或重组蛋白活性下降。因此,在分装冻存时,一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度,因为大量的载体蛋白可以保证任意浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。一般情况下,推荐的稀释倍数是原重悬浓度的5-10倍,稀释后的细胞因子或重组蛋白的浓度不低于10 ug/ml。

 

那么,含载体蛋白的溶液是什么溶液呢?水可以吗?

答:水是不可以的。该溶液通常是指pH接近中性,有一定缓冲能力的缓冲液,如PBS,培养液(RPM1640,DMEM等)等。

还有一个经常被问及的问题,即在做无血清培养或动物体内实验时,细胞因子中不能含有

 

BSA、FBS或HSA等动物或人的蛋白,想要长期保存细胞因子或重组蛋白应该怎么办呢?

答:一种方法是订购Peprotech的小包装(Size A)细胞因子或重组蛋白,每次使用一支,用后即废弃。如觉得此方法过于浪费,可使用5%海藻糖(Fucose)作为载体,用含海藻糖的溶液来稀释已经重悬的细胞因子或重组蛋白,然后分装冻存。





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