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三维培养细胞活性及毒性检测

2021-05-18
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细胞培养于悬滴(hanging drop), 自组装形成球状细胞簇。 Cayman采用3D Biomatrix公司的3D细胞培养平台,开发出了两款全新的试剂盒用于研究Perfecta3D®培养板上的球状体(spheroid)细胞。即Perfecta3D®细胞活力检测试剂盒及Perfecta3D®细胞毒性检测试剂盒,可快速精准的检测球状体的一些基本细胞过程。
 
研究复杂的细胞和组织,及其信号传导与调控可不是件容易事。而模拟细胞或组织环境,建立最接近体内天然条件的实验系统同样困难。这就是3D细胞培养所面临的挑战,3D培养系统旨在更好的模拟细胞的体内生长环境。近来越多的证据表明,3D细胞培养系统比传统2D培养系统更贴近体内的生理条件。美国3DBiomatrix公司生产的Perfecta3D®悬滴板是一个新的三维细胞培养平台,能够在多孔板模式中形成大小均匀的球状体悬滴;这种悬滴是细胞自组装形成的球状细胞簇,是三维(3D)细胞培养和筛选中研究的最有利的模型之一。同其他类型的3D支架和水凝胶等方法相比,这种球状体具有简单性,可重复性以及生理组织的相似性,能模拟组织肿瘤固有的代谢(氧气、二氧化碳、养分、废物)和增殖梯度变化。作为优良的生理肿瘤模型可以提供比2D细胞培养更可靠的结果。

 三维培养细胞活性及毒性检测



图1. Perfecta3D®悬滴培养板促进细胞球体在悬滴中的培养。用移液器将细胞悬液加入每个孔,细胞自组装形成的球状细胞簇。


应用一. 细胞活性检测
 在细胞研究中,对细胞活性及细胞毒理的检测是一项基本的细胞学技术,通常采用WST-1法。WST-1是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的可溶性formazan盐。Formazan产物的吸光度与活细胞的数量及活性成正比。
 
Cayman开发的Perfecta3D®细胞活力检测试剂盒(产品编号:600990), 提供3D细胞培养板、WST-1试剂、电子媒介体溶液(Electron Mediator Solution)以及分析用的圆底板。如图2所示,HEK293细胞以不同细胞密度培养于悬滴中,设置Vehicle对照以及逐渐增加Triton X-100浓度的实验组(处理1小时)。然后转移细胞至圆底板,与WST-1溶液孵育,最后在450nm读数。OD值随细胞数升高,随Triton X-100浓度的升高而降低。

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图2. 起始细胞数量对450nm吸光度的影响。HEK293细胞以不同起始细胞密度加入3D培养板,将培养板移入37度CO2孵育箱中。4天后,细胞经Vehicle, 0.001%或0.01% Triton X-100处理1小时,然后转移至圆底板,每孔加入WST-1试剂。细胞于37度孵育3.5小时后,于450nm测定吸光度。


应用二. 细胞毒性检测 
细胞膜完整性的丧失是细胞毒性的表现形式之一,导致细胞的渗漏。LDH是一个可溶性的胞浆酶,可从受损细胞释放到培养基中,因此被用作细胞溶解、细胞毒性以及细胞活性等的标志分子。Cayman开发的Perfecta3D®细胞毒性检测试剂盒(产品编号:601050)提供3D细胞培养板以及检测LDH的必需试剂。细胞培养于悬滴中,通常含40-50ul的培养基,如要处理细胞,可移出10ul培养基,加入含有测试化合物的替换培养基。进行细胞毒性检测时,可移出10ul培养基,然后将细胞转移至标准的96孔板,用LDH试剂进行检测。490nm读数,吸光度与LDH浓度线性相关(图3)。
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图3. LDH标准曲线。LDH标准品溶于不含FBS的RPMI 1640中,然后每孔加入100ul的反应液,室温孵育30分钟。







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